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Générateur de cavitation reproductible : exemples d’application biologique in vitro
ultrasons avec des agents pharmacologiques, comme
la délivrance de drogue localisée [6] ou l’excitation de
sono-sensibilisant en sonodynamothérapie [7]. En tout
état de cause, l’utilisation des ultrasons en thérapie géni-
que (transfection) est délicate car la sonoporation et
la destruction cellulaire apparaissent pour des niveaux
ultrasonores apparemment similaires. Et, même si l’uti -
lisation d’agents de contrastes ultrasonores ou l’aug-
mentation de la quantité de gaz dissous dans le milieu
permettent de favoriser la transfection [8], il est difficile
d’obtenir des rendements de transfection conséquents
sans effets cytotoxiques majeurs. De plus, la cavitation
ultrasonore apparaît comme un phénomène très aléa-
toire, notamment quand le point de fonctionnement se
situe au voisinage du seuil de cavitation inertielle. Aussi,
pour une intensité acoustique donnée, l’état de cavita-
tion peut être très différent et instationnaire. Puisque la
sonoporation est dépendante des aléas du phénomène
de cavitation, lui-même non-maîtrisable par un système
d’irradiation à intensité acoustique constante, ces études
de sonoporation sont complexes à mettre en œuvre. Un
contrôle pertinent et permanent de l’activité de cavita-
tion dans le milieu irradié sera susceptible de fortement
réduire, voire supprimer l’influence du dispositif physi -
que et des conditions expérimentales dans les essais
biologiques répétitifs. À cette fin, un dispositif de régu-
lation du niveau de cavitation a été développé. Il s’appuie
sur un critère de niveau de cavitation (indice de cavita-
tion CI) déterminé à partir du signal acoustique issu du
milieu cavitant [9].
Pour évaluer ce nouveau générateur, nous proposons de
présenter son emploi dans deux applications :
- son implication dans une étude concernant la caractérisa-
tion des mécanismes de destruction cellulaire potentialisée
par un agent photosensibilisant : le Photofrin
©
(PF) ;
- son emploi comme moyen de transfection le plus appro-
prié pour certaines cellules en suspension.
Matériels et méthodes
Dispositif expérimental
Fig. 1 : Dispositif expérimental ; a) Dispositif d’irradiation
ultrasonore positionné sous la plaque de
culture utilisant l’eau comme couplant ; b) Vue
latérale et c) vue supérieure du dispositif
Le milieu à irradier est placé dans des puits d’une plaque
de culture cellulaire, à raison de 2 ml par puits (plaque
12 puits en polystyrène ; diamètre des puits : 20 mm ;
BD Science). L’onde ultrasonore est générée par un trans-
ducteur piézoélectrique plan de diamètre 20 mm, situé
à 9 mm en dessous du puits. Le tout est placé dans un
bain d’eau dégazée qui assure le couplage acoustique.
L’excitation ultrasonore est une onde sinusoïdale continue de
fréquence f
0
= 445 kHz. La durée d’irradiation ultrasonore
choisie sera généralement de 60 s. L’intensité acoustique
maximale délivrée est de 3,5 W.cm
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en moyenne spatiale,
et la pression maximale est de 0,63 MPa. Latéralement
au transducteur et sur le même support est fixé un hydro-
phone en PVDF (bande passante : 10 MHz) de diamètre
10 mm, orienté vers le puits irradié. Il permet de relever le
signal acoustique diffusé au travers de ce puits. Le signal
de réception est amplifié (20 dB, BX31, NF Electronic
Instruments) numérisé (carte d’acquisition PXI-5620, résolu-
tion 14 bits, fréquence d’échantillonnage 64 MHz, National
Instruments), transféré sur un calculateur (PC + LabVIEW)
puis traité (Figure 2). Ce traitement consiste à en déter-
miner le spectre fréquentiel dans la bande 0,1 à 7,1 MHz
puis un indice de cavitation (CI) comme la moyenne arith-
métique des intensités acoustiques en dB sur les fréquen-
ces considérées [9]. Ce critère CI d’évaluation de la cavi-
tation acoustique permet de mieux prendre en compte
le bruit large bande associé à la cavitation inertielle au
profit des raies fréquentielles associées principalement
à la fréquence de la source ultrasonore.
Le processus de régulation s’appuie sur un modèle de
type «boite noire» à une entrée (CI) et une sortie (puis-
sance d’excitation) et sur la technique de régulation par
commande prédictive parfaitement adapté à ce modèle.
Ainsi, à chaque boucle de contrôle (cadencement 200 Hz),
la régulation prend en compte l’état actuel du processus
et deux états antérieurs pour établir la commande de puis-
sance à appliquer (Figure 2).
Fig. 2 : Schéma général du dispositif de contrôle de
cavitation. La commande de puissance est traduite en
contrôle de gain d’un amplificateur à gain variable
Aspect biologique
Les cultures de cellules tumorales adhérentes AT2 (Dunning
R 3327) sont réalisées dans un incubateur à 37°C pendant
3 jours (durée moyenne nécessaire aux cellules pour
atteindre la fin de leur phase exponentielle de crois-
sance). Les cellules sont alors lavées (PBS 1X), décollées
(mélange trypsine-EDTA 1X), lavées à nouveau, centrifu-
gées et placées dans du milieu de culture sans sérum
à raison 2,5.10
6
cellules/ml. Ce milieu est réparti dans
des puits de plaque de culture (12 puits, BD) à raison
de 2 ml/puits. Ces échantillons de culture sont parta-
gés en 2 groupes. À chaque puits de l’un des groupes
est rajouté du Photofrin
©
PF (20 µg/ml ; volume addition-
nel : 40 µl). Les 2 groupes sont ensuite placés en incubation
pendant 20 min avant de réaliser le traitement ultrasonore.